DIAGNÓSTICO INDIRETO DE PORTADORES DE MUTAÇÕES NO GENE F9 CAUSADORAS DE HEMOFILIA B, UTILIZANDO UM TESTE MOLECULAR INÉDITO DE TIPAGEM.

Resumo

A hemofilia B é uma desordem hemorrágica hereditária recessiva ligada ao cromossomo X, causada por alterações no gene F9 codificador do fator IX de coagulação. A análise direta de mutações via sequenciamento é dificultado pelo padrão variável das mutações. O presente projeto tem como meta introduzir a análise de ligação de marcadores polimórficos como método indireto para o diagnóstico de portadores de mutações no atendimento integral das famílias dos acometidos.Foi feita uma varredura in silico em 3 genomas de referência para repetições curtas em tandem (STR) de DNA utilizando programas para a mineração (Tandem Repeat Finder) e validação: OligoPerfect™ Designer da Invitrogen™ e o OligoCalc Oligonucleotide Properties Calculator. Foram selecionados STR tetra- e pentanucleotídeos para desenvolver dois ensaios multiplex de PCR (QF-PCR). Os produtos da QF-PCR foram submetidos à separação eletroforética em capilar utilizando o analisador automático.Foram identificados oito loci STRs inéditos, sendo sete tetranucleotídeos e um pentanucleotídeo, extragênicos. Para o desenvolvimento dos testes moleculares foi incluído um marcador STR dinucleotídeo F9 intragênico já conhecido. Os pares de iniciadores específicos para cada marcador foram testados em reações de PCR gradiente (58ºC-63ºC) em reações uniplex, biplex, etc. Assim foram desenvolvidos dois ensaios multiplex pilotos.O teste envolvendo as duas reações multiplex mostrou se altamente eficiente no rastreio de haplótipos que co-segregam com o gene F9 mutado, o que contribuirá para o aconselhamento genético.