1 Introdução

A vegetação de restinga é definida como um grupo de comunidade vegetal associada a depósitos arenosos costeiros e ambientes rochosos litorâneos (BRASIL, 2009). Parte dessa vegetação possui aplicação terapêutica, sendo utilizada principalmente por comunidades pesqueiras. Entre as espécies presentes em restingas mais empregadas por essas comunidades estão o bajirú (Chrysobalanusicaco L.), aplicado no tratamento de diabetes e pedras nos rins, a pitanga (Eugenia uniflora L.), usada como antitérmico e antidiarreica, e a aroeira (Schinusterebinthifolius R.), empregada como adstringente e cicatrizante (FONSECA-KRUEL et al., 2006).

Na literatura existem estudos que relatam algumas atividades biológicas para essas espécies. O bajiru apresentou ação hipoglicemiante (CASTILHO; SOUZA; GUIMARAES, 2000); a pitanga, atividades antibiótica, antidiarreica e analgésica (SOUZA et al., 2004; SCHUMEDA et al., 1987); e a aroeira, propriedades cicatrizantes (LUCENA, 2006).

A utilização popular e a evidência científica de benefícios atribuídos às plantas de áreas de restinga demonstram a importância de estudos químico/biológicos de espécies nativas desse ecossistema.

Dentro desse contexto, destaca-se a espécie Guapira pernambucensis (Nyctaginaceae), conhecida popularmente como farinha-seca-do-litoral, farinha-seca e carne-de-vaca (SOUZA; JARDIM; COELHO, 2016). De forma geral, a espécie apresenta hábito arbustivo com até 2 m, suas folhas são opostas e glabras. As flores de cor creme esverdeada com estames alvos são diclinas com botão floral tubuloso podendo ser estaminadas ou pistiladas. Os frutos vinosos possuem forma globular, antocárpio com coroa fechada ou ereta (Figura 1) (FURLAN; GIULIETTI, 2014).

Figura 1.
Espécime de G. pernambucensis
Fonte: Mercadante, M. Disponível em: https://www.flickr.com/photos/mercadanteweb/31161762124

Seu habitat se concentra na maior parte do litoral brasileiro em praias, ilhas, dunas e restingas (Figura 2). Sendo endêmica do Brasil, pode ser encontrada nos estados da região Sudeste e Nordeste, com exceção dos estados de Minas Gerais, Piauí e Ceará (SÁ, 2015; FURLAN; GIULIETTI, 2014).

Figura 2.
Distribuição geográfica da espécie G. pernambucensis no Brasil
Fonte: Furlan e Giulietti (2014)

Tradicionalmente, os frutos são empregados como fonte de alimento e também como corante (SANTOS et al., 2009), porém na literatura não existem relatos de aplicações da espécie na medicina popular.

Estudos fitoquímicos realizados com espécies do gênero são raros na literatura, porém para G. noxia, espécie mais estudada do gênero, foram verificadas atividades antiúlcera, antimicrobiana e imunomodulatória, e a presença de flavonoide, alcaloide e ciclitol (SEVERI, 2007). A espécie G. graciliflora foi considerada como uma potencial fonte de compostos bioativos eficazes no tratamento de infecções (ARAÚJO, 2014). Até o momento não há relatos na literatura sobre estudos fitoquímicos da espécie G. pernambucensis; sendo assim, esta é a primeira abordagem sobre seu perfil químico, atividade antioxidante e citotóxica.

2 Materiais e métodos

2.1 Procedimentos experimentais gerais

O radical DPPH (2,2’-difenil-1-picril-hidrazila) foi adquirido da Sigma Aldrich e a rutina da Merck. Os demais solventes e reagentes utilizados nas análises foram analiticamente puros da marca Synth.

2.2 Equipamentos

A concentração dos extratos e frações foi efetuada em evaporador rotativo, Fisatom 802. As soluções aquosas foram liofilizadas em liofilizador Thermo Savant. Os espectrofotômetros UV-Vis utilizados foram o Bel Photonics (modelo 1105) e o Shimadzu (modelo UV-1800).

2.3 Coleta e Identificação do material vegetal

O material vegetal foi coletado na restinga de Grussaí/Iquipari no município de São João da Barra – RJ, em janeiro de 2001. A exsicata foi depositada sob o número HUENF 5911 e identificada por especialistas do Herbário da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF).

2.4 Obtenção dos extratos brutos

As folhas (803,7 g), após secas, moídas e pesadas, foram submetidas à maceração exaustiva utilizando os solventes hexano e metanol em ordem crescente de polaridade. Os extratos foram filtrados e evaporados sob pressão reduzida, transferidos para frascos previamente pesados e mantidos em capela de exaustão até peso constante.

Esse procedimento forneceu 0,33 g (0,04%) de extrato em hexano e 35,12 g (4,37%) de extrato em metanol.

2.5 Triagem fitoquímica

O perfil químico dos extratos brutos (em hexano e metanol) foi avaliado qualitativamente para identificação dos metabólitos secundários (Tabela 1).

2.6 Análise quantitativa do teor de flavonoides totais

A quantificação de flavonoides no extrato metanólico foi feita utilizando-se o método do AlCl₃ (RIO, 1996). A análise baseia-se na formação do complexo flavonoide/alumínio que pode ser observado pela intensificação da cor e da absorção (efeito hipercrômico e desvio batocrômico) quando analisado por espectrofotometria na região do ultravioleta-visível (UV-Vis) (MARQUES et al., 2012).

O desvio batocrômico ocorre porque o cátion Al³⁺ forma complexos estáveis com as hidroxilas livres nas posições 3-, 5- e 3’-, 4’- no esqueleto flavonoídico, ocasionando a extensão do sistema conjugado. Dessa maneira, é possível determinar o teor de flavonoides evitando-se a interferência de outras substâncias fenólicas, principalmente os ácidos fenólicos, pois estes apresentam comprimentos de onda inferiores ao do complexo flavonoide – Al³⁺(MARQUES et al., 2012).

Foi construída uma curva de calibração com o padrão rutina com concentrações na faixa de 6,8 a 17,0 μg/mL. A cada uma das concentrações foi acrescentado 1,0 mL da solução de cloreto de alumínio 5% em metanol (m/v). A uma alíquota de 15 mL da solução do extrato (1,0 mg/mL) adicionou-se 1,0 mL da solução de AlCl_3, em seguida o volume foi completado para 50 mL com metanol.

As medidas foram feitas em espectrofotômetro UV-Vis a 425 nm. O resultado obtido foi expresso em miligramas equivalentes a rutina por grama de extrato (mg ER/g).

2.7 Análise quantitativa da atividade antioxidante

A literatura apresenta diversos métodos empregados na avaliação da atividade antioxidante de extratos, frações e substâncias puras. No entanto, o mais utilizado consiste em avaliar a atividade sequestradora do radical livre 2,2’-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH). Na análise foi empregado o método descrito por Sousa e colaboradores (2007). O DPPH é um radical estável à temperatura ambiente apresentando coloração violeta quando em solução e comprimento de onda máximo (λ_max) em aproximadamente 515 nm. Quando em contato com uma substância doadora de hidrogênio ou elétrons, ele é reduzido formando o difenil-pricril-hidrazina de coloração amarela com consequente perda da absorção (MENSOR et al., 2001).

A curva de calibração foi construída a partir dos valores da absorbância das soluções de DPPH nas concentrações de 1,0 μg/mL a 40,0 μg/mL, utilizando metanol como branco.

As soluções metanólicas do extrato em metanol e do controle positivo (rutina) foram preparadas nas concentrações de 25,0 μg/mL a 250,0 μg/mL. Como branco utilizou-se a mistura de 2,7 mL de metanol e 0,3 mL da solução do extrato. Os valores de absorbância das misturas reacionais (0,3 mL da amostra + 2,7 mL da solução de DPPH 40,0 μg/mL) em todas as concentrações testadas, após 30 minutos de repouso, foram convertidos em porcentagem de atividade antioxidante (%AA), determinada pela equação:

Onde: Abs_controle é a absorbância da solução metanólica de DPPH a 40 μg/mL e Abs_amostra é a absorbância da mistura reacional (DPPH + amostra).

As medidas das absorbâncias foram feitas em espectrofotômetro UV-Vis no comprimento de onda 515 nm. Os resultados obtidos foram expressos em porcentagem de atividade antioxidante (%AA) e em concentração efetiva para reduzir a concentração inicial de DPPH em 50% (CE₅₀).

2.8 Análise da toxicidade frente às larvas de Artemia salina

A análise foi realizada segundo a metodologia proposta por Meyer et al. (MEYER et al., 1982). O bioensaio é considerado simples e permite determinar a dose letal para reduzir a população de náuplios em 50% (DL₅₀). No procedimento utilizaram-se cinco soluções do extrato metanólico nas concentrações de 0,22; 0,44; 0,89; 1,33 e 2,22 mg/mL. O extrato foi solubilizado na mistura água marinha/DMSO 1% na proporção 3:2 (v/v).

Aproximadamente 15 larvas de A. salina foram colocadas em contato com cada concentração do extrato testada. Após 24 horas, foi realizada a contagem dos indivíduos mortos.

As análises foram feitas em triplicata e os dados obtidos tratados estatisticamente pelo método log-Probit para determinação dos valores de DL₅₀.

2.9 Análise Estatística

Os experimentos foram feitos em triplicata e os resultados apresentam a média de três experimentos distintos e seu desvio padrão.

3 Resultados e Discussão

A avaliação fitoquímica é considerada um desafio quando se verifica o crescente interesse por fitoterápicos, sendo papel do pesquisador investigar de maneira cuidadosa espécies com possíveis aplicações terapêuticas (SILVA; MIRANDA; CONCEIÇÃO, 2010). O estudo fitoquímico permite identificar classes de metabólitos presentes em espécies vegetais com possíveis aplicações medicinais (SIMÕES, 2001).

A avaliação fitoquímica preliminar dos extratos brutos da espécie G. pernambucensis utilizando testes químicos qualitativos possibilitou identificar o perfil químico dos metabólitos presentes na espécie.

A reação de Libermann-Buchard é empregada na identificação de triterpenos e esteroides. Quando os reagentes são adicionados à amostra contendo esses metabólitos, ocorre uma mudança de coloração do meio reacional. O desenvolvimento da coloração esverdeada se dá devido à formação de um derivado sulfônico que absorve em torno de 416 nm, indicando resultado positivo para o teste (BARBOSA et al., 2004).

Os ensaios para identificação de alcaloides, fenólicos, flavonoides e proantocianidinas não foram realizados com o extrato em hexano em virtude da diferença de polaridade do extrato com os solventes empregados nos testes.

A presença de átomos de nitrogênio em uma molécula confere a ela um caráter básico, o que possibilita a formação de sal quando em meio ácido. O reagente de Dragendorff é uma solução de iodeto de bismuto e potássio [K(BiI₄)] em ácido diluído e, quando em presença de alcaloides, forma precipitado laranja avermelhado (DENNY et al., 2007; BARBOSA et al., 2004).

A identificação de fenóis foi efetuada por meio da reação com FeCl₃. Fenólicos em geral na presença de FeCl₃ formam um complexo colorido cuja coloração pode variar entre violeta, azul, verde e amarelo-castanho, dependendo do tipo de substância fenólica analisada (BARBOSA et al., 2004).

Para a verificação da presença de flavonoides, foram empregadas as reações com AlCl₃ e NaOH, reagentes específicos para a identificação dessa classe de metabólito.

Os cátions Al³⁺ formam complexos estáveis com as hidroxilas em posição orto presentes nos flavonoides aumentando o sistema conjugado, enquanto que o NaOH, por ser uma base forte, é capaz de ionizar todas as hidroxilas presentes no esqueleto flavonoídico. Em ambos os testes ocorre um desvio batocrômico e um efeito hipercrômico. O resultado da reação com AlCl₃ pode ser observado pela intensificação da fluorescência dos extratos analisados. Na reação com o NaOH observa-se a intensificação da cor (MOUCO; BERNADINO; CORNÉLIO, 2003).

Na reação de Shinoda ocorre a oxidação do magnésio com liberação de gás hidrogênio sendo aplicada na identificação de flavonoides. O resultado da reação é avaliado pela mudança de coloração. O surgimento da coloração róseo-avermelhada indica a presença de flavononas, enquanto a coloração alaranjada, a presença de flavonas (MOUCO; BERNADINO; CORNÉLIO, 2003).

O método da butanólise é citado como o melhor ensaio para determinar a presença de proantocianidinas dada sua alta seletividade (HAGERMAN; BUTLER, 1989). O teste se fundamenta na reação colorimétrica com intensa absorção na região de 550 nm após o tratamento com ácido. Em meio ácido, alcoólico e a quente, as proantocianidinas liberam antocianidinas em razão da quebra das ligações entre as unidades monoméricas. No extrato metanólico antes e após a reação, a leitura das absorbâncias (Figura 3) permitiu observar o aparecimento de uma banda em 548 nm (pico 1), confirmando a presença de antocianidinas (SANTOS; MELLO, 2003).

Figura 3.
Espectros de UV-Vis antes (A) e depois (B) da reação de butanólise do extrato metanólico de G. pernambucensis
Fonte: Os autores

Os resultados observados (mudança de coloração e/ou formação de precipitado) para a espécie G. pernambucensis estão resumidos na Tabela 2. Para o extrato em hexano, verificou-se a presença de esteroides e, no extrato metanólico, a presença de alcaloides, flavonoides, proantocianidinas e fenólicos em geral.

Os compostos fenólicos presentes em plantas podem ser divididos em várias classes, dentre elas destacam-se os ácidos fenólicos, flavonoides e taninos condensados e hidrolisáveis (NACZK; SHAHIDI, 2004). Tendo em vista que o extrato metanólico apresentou resultados positivos para fenólicos e flavonoides, realizou-se, então, a quantificação do seu teor de flavonoides totais.

Na análise, os valores de absorbância em triplicata medidos a 425 nm foram utilizados na construção da curva de calibração (absorbância versus concentração), que forneceu a equação da reta y = 0,0053x – 0,0175 (R² = 0,9755). Por intermédio desta, foi possível calcular o teor de flavonoides totais para o extrato metanólico, cujo valor foi de 20,4 ± 0,50 mg ER/g do extrato.

Devido à escassez de trabalhos com espécies do mesmo gênero, comparar os teores de flavonoides totais tem se mostrado uma tarefa difícil. Severi (2007) verificou em G. noxia 133,0 mg/g no extrato metanólico. Chaves (2012) realizou um estudo com a espécie G. graciliflora, comparando os teores de flavonoides totais em diferentes estações do ano (verão e inverno), e observou concentrações de 0,00756 mg/g e 0,0145 mg/g no extrato etanólico no verão e inverno, respectivamente. Sendo assim, o teor encontrado no presente trabalho é cerca de 6 vezes menor ao valor encontrado por Severi (2007) e aproximadamente 1.000 vezes maior que o teor indicado por Chaves (2012).

Diversas substâncias são consideradas antioxidantes naturais, incluindo os fenólicos. Entre os compostos fenólicos, os flavonoides se destacam pela capacidade de atuar como proteção contra danos oxidativos causados por radicais livres (YUNES; CALIXTO, 2001). Em vista da constatação da presença de flavonoides no extrato metanólico, procedeu-se à determinação da atividade antioxidante. Empregando-se os valores de porcentagem de atividade antioxidante versus concentração (Figura 4), obteve-se a equação da reta para o padrão positivo rutina e para a amostra, possibilitando, assim, o cálculo dos valores de CE₅₀.

A rutina apresentou uma CE₅₀ = 50,06 ± 0,29 μg/mL, e o extrato metanólico uma CE₅₀ = 280,90 ± 1,15 μg/mL. Quando comparados, os resultados demonstram que o extrato metanólico apontou uma capacidade antioxidante cerca de cinco vezes menor que o padrão rutina. Ressalta-se que quanto menor o valor de CE₅₀ maior é o potencial antioxidante da amostra.

O valor de CE₅₀ obtido para a espécie em estudo foi similar ao valor descrito por Cabral (2014) para a espécie G. laxa (CE₅₀ 295,68 ± 6,29).

Figura 4.
Porcentagem de Atividade Antioxidante do padrão positivo (rutina) e da amostra (extrato metanólico) das folhas de G. pernambucensis pelo método do DPPH
Fonte: Os autores

A relação entre a presença de flavonoides e a potencial antioxidante é dependente da conformação estrutural, da posição e do número de grupos hidroxilas presentes na molécula (MENSOR et al., 2001); por exemplo, a presença de hidroxilas na posição orto do anel B do esqueleto flavonoídico potencializa sua ação antioxidante (Figura 5) (WU et al., 2009; VAN ACKER et al., 1996).

Figura 5.
Características estruturais responsáveis por potencializar a ação antioxidante
Fonte: WU et al.(2009) e VAN ACKER et al.(1996)

Cao, Sofic e Prior (1997) verificaram que flavonoides monoidroxilados demonstram baixo potencial antioxidante, como por exemplo, flavonas com apenas uma hidroxila na posição 3, 6, 3’ ou 4’ e flavononas monoidroxilada na posição 2’, 3’, 4’ ou 6’ (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006). Segundo Barreiros, David e David (2006), a estabilidade do radical livre flavonoil depende da deslocalização do elétron desemparelhado.

Uma vez que o teste qualitativo com NaOH indicou a presença de flavonas no extrato, supõe-se que a maior parte desses flavonoides são monoidroxilados, justificando a baixa atividade antioxidante observada.

Quanto à atividade citotóxica, pesquisadores definem o teste de toxicidade frente às larvas de A. salina como uma avaliação preliminar que indica a possibilidade de o extrato bruto ou fração apresentar algumas atividades biológicas como, por exemplo, atividades antifúngica e antimicrobiana (SIQUEIRA et al., 1998).

A avaliação da atividade citotóxica foi realizada apenas com o extrato metanólico, uma vez que o extrato hexânico não foi solúvel na mistura de solventes empregada (DMSO/H₂O) no teste.

Os resultados apresentados frente às larvas do microcrustáceo foram reunidos, e os dados, tratados estatisticamente pelo método log-Probit para se obterem os valores de DL₅₀. Quanto menor o valor de DL₅₀ maior será a atividade citotóxica, indicando um potencial biológico (MEYER et al., 1982).

Os extratos são classificados como de alta citotoxicidade quando apresentam DL₅₀ menor que 100 μg/mL, moderada entre 100 e 500 μg/mL, e fraca de 500 a 1000 μg/mL (NGUTA et al., 2012); logo, o extrato metanólico das folhas de G. pernambucensis apresentou uma atividade citotóxica moderada com uma DL₅₀ = 171 μg/mL.

4 Conclusão

A avaliação preliminar expôs informações relevantes sobre o perfil químico dos extratos das folhas da G. pernambucensis, indicando a presença de triterpenos, esteroides, alcaloides, fenólicos, flavonoides e proantocianidinas. A determinação do teor de flavonoides totais apresentou um resultado significativo igual a 20,4 ± 0,50 mg ER/g do extrato. No entanto, foi verificado baixo potencial antioxidante no extrato metanólico (CE₅₀ foi de 280,90 ± 1,15 μg/mL). O ensaio para determinação de toxicidade sobre as larvas de A. salina evidenciou que o extrato metanólico foi moderadamente ativo com DL₅₀ = 171,0 μg/mL. As classes metabólicas identificadas servirão como guia para futuro processo de isolamento e caracterização dos metabólitos supracitados. Os resultados obtidos revelaram-se promissores, incentivando o seguimento da investigação fitoquímica da espécie.

Agradecimentos

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de financiamento 001. Os autores também agradecem à UENF e à FAPERJ pelo apoio financeiro.

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Notas de autor