1 Introdução

Bactérias Ácido Láticas (BAL) constituem um grupo de microrganismos gram-positivos, com morfologia de cocos ou bacilos, não formadores de esporos, catalase e oxidase negativa e produtores de ácido lático por meio da fermentação de açúcares (FUGELSANG; EDWARDS, 2007; MAKAROVA; KOONIN, 2007). De acordo com Mogensen et al. (2003), essas bactérias pertencem aos gêneros: Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus Vagococcus e Weissella.

Esses microrganismos são amplamente encontrados em leite cru e em queijo frescal artesanal. Nesse tipo de queijo, devido ao fato de sua produção ocorrer, geralmente, com leite não pasteurizado, o desenvolvimento da microbiota nativa de BAL é favorecido, sendo sua caracterização diferenciada de acordo com a região produtora (DE SOUZA et al., 2021). Segundo Jay (2013), os gêneros de BAL mais encontrados nesses produtos são: Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc e Lactobacillus.

Outra característica é que elas também podem ser encontradas no solo, na água e no trato digestivo de animais, sendo também frequentemente utilizadas em diversos alimentos fermentados, contribuindo para formação de suas características sensoriais (AXELSSON et al., 2003; FORSYTHE, 2013; HOLZAPFEL et al., 2001). São muito utilizadas como fermento lácteo, devido à fermentação da lactose, possibilitando a criação de subprodutos como: iogurtes, queijos, leites fermentados e outros, sendo Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Leuconostoc e Enterococcus os gêneros mais encontrados (BERESFORD et al., 2001; FOX et al., 2000; RAMOS et al., 2013; ROLIM et al., 2014).

A fermentação realizada pode se dar por duas vias, de acordo com a característica de origem da bactéria fermentadora. O grupo das BAL homofermentativas produzem ácido lático a partir de açúcares simples como a glicose. Já as heterofermentativas, além de produzirem ácido lático, também produzem dióxido de carbono, ácido acético, etanol, aldeído e diacetil (BRUNO, 2009).

Os produtos oriundos dos processos fermentativos possibilitam sua aplicação na indústria de alimentos, pois estes podem desempenhar o papel de aromatizantes, acidulantes, flavorizantes, tamponantes e inibidores de bactérias deteriorantes em alimentos processados, tais como produtos de panificação, bebidas, lácteos e cerveja (CAPELLARI, 2010; FORSYTHE, 2013).

O emprego das BAL na indústria alimentícia também está diretamente ligado ao seu papel antimicrobiano. Ao fermentar a lactose, esses organismos produzem substâncias (ácido lático e diacetil, compostos metabólitos e bacteriocinas) que atuam como barreiras frente ao desenvolvimento de patógenos, garantindo uma maior segurança nos alimentos (ALEXANDRE et al., 2002; BONOMO; RICCIARDI; SALZANO, 2011; GUERRA; BERNARDO, 2005; JAY, 2013; REIS et al., 2012).

O diacetil, um dos metabólitos produzidos pelas BAL, se destaca por seu potencial aromático, estando sua produção ligada à característica intrínseca de algumas dessas bactérias em metabolizar o citrato. Além de sua capacidade de flavor, o composto possui a capacidade de inibir o desenvolvimento de alguns microrganismos, atuando diretamente em suas funções vitais (BARTOWSKY; HENSCHKE, 2004; HOR; LIONG, 2014; PASSERINI et al., 2013).

As bacteriocinas são compostos de origem proteica que podem contribuir com a maior segurança dos produtos fermentados (BALCIUNAS et al., 2013). Dentre as cepas produtoras dessas proteínas destacam-se os gêneros Lactobacillus, Lactococcus e Streptococcus (CHEN; HOOVER, 2003). A produção de ácidos orgânicos, sais e bacteriocinas por algumas BAL apresentam alta atividade antagonista frente a Listeria monocytogenes, reconhecidamente patogênica para a saúde humana e veiculada através de certos tipos de alimentos (PELCZAR JR.; CHAN; KRIEG, 1997; VAZQUEZ-BOLAND et al., 2001).

Microrganismos pertencentes ao gênero Listeria apresentam como características o formato de bastonetes curtos e são gram-positivo não formadores de esporos. Das oito espécies identificadas, apenas a L. monocytogenes é reconhecida como patogênica ao ser humano (GOPAL et al., 2010; SWAMINATHAN, 2001; VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2001), provocando a listeriose, doença de baixa incidência (SWAMINATHAN; GERNER-SMIDT, 2007) que pode provocar a morte (SILVA, 2007; ZHANG; JAYARAO; KNABEL, 2004).

A lactofermentação é uma análise simples que consiste na verificação do tipo de coágulo formado, servindo como indicativo da microbiota presente na matéria-prima. Essa prova também pode ser utilizada como verificação do potencial tecnológico da BAL, pois indica o tipo de coágulo formado, podendo servir como indicativo de finalidade à qual a cepa poderá ser destinada (produção de queijos, iogurte e outros). Os tipos de coágulos mais encontrados nesse processo são o gelatinoso e o caseoso, sendo o coágulo gelatinoso oriundo de fermentação lática, indicando predominância de BAL, e o caseoso de uma fermentação proteolítica, indicando predominância de uma microbiota proteolítica (FIGUEIREDO et al., 2016; PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006).

Tendo ciência da importância das BAL na segurança alimentar, o trabalho visa conhecer as características de isolados autóctones de BAL do município de Bom Jesus do Itabapoana/RJ (BJI), observando sua capacidade de antagonismo contra L. monocytogenes, produção de diacetil e tipo de lactofermentação realizada.

2 Metodologia

2.1 Coleta das amostras

Foram coletadas, em frascos estéreis, seis amostras de leite cru oriundas de tanques de expansão refrigerados comunitários e individuais, localizados no 1º distrito do município de Bom Jesus do Itabapoana/RJ e cinco amostras de queijo frescal artesanal, coletadas em feiras e locais de vendas de produtos dos produtores rurais do mesmo município.

As amostras foram transportadas em caixas isotérmicas com gelo para o Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Água do Campus Bom Jesus do Itabapoana do Instituto Federal Fluminense para a realização das análises.

2.2 Contagem de BAL

As amostras de leite cru foram homogeneizadas por agitação manual em seus frascos de coleta. Em seguida foram realizadas diluições decimais utilizando como diluente Solução de Citrato de Sódio a 2% (Dinâmica®). A primeira diluição das amostras de queijo frescal artesanal foi realizada com pesagem de 25 g da amostra e adição de 225 mL de Solução de Citrato de Sódio a 2%, seguido de homogeneização em Stomacher por 120 segundos. As demais diluições foram realizadas em tubos, utilizando a mesma solução diluente.

A contagem de bactérias ácido láticas foi realizada com as quatro diluições de leite cru e com as diluições de 10⁴ a 10⁸ das amostras de queijo frescal artesanal, seguindo o método de plaqueamento por profundidade, em duplicata, utilizando os meios Ágar MRS (Man, Rogosa e Sharpe - Acumedia®) e Ágar M17 (Himedia®), em jarra de anaerobiose com atmosfera modificada de CO₂ a temperaturas de 37 ºC e 30 °C por 48 horas, respectivamente.

2.3 Isolamento e identificação fenotípica das BAL

A partir da observação de colônias de BAL morfologicamente diferentes, 96 delas foram isoladas em caldo BHI (Brain Heart Infusion - Fluka®) e incubadas a 37 ºC por 48 horas, sendo posteriormente feito estriamento em Ágar MRS e M17, seguindo o meio original de crescimento da colônia que deu origem à cepa isolada para se confirmar a pureza. As placas foram incubadas de acordo com o mesmo método descrito no tópico anterior.

Para confirmação de BAL, esfregaço seguido de coloração de Gram e prova de catalase foram realizadas. Observou-se, ainda, o aspecto morfológico buscando-se diferenciar os cocos e bastonetes/bacilos, que são as formas predominantes no grupo de microrganismos pesquisado (ANAL; SINGH, 2007).

As cepas selecionadas para as etapas subsequentes foram as que apresentaram características gram-positiva e catalase negativa, sendo estocadas, sob refrigeração, em caldos BHI (Fluka®) e Ágar Nutriente Inclinado (Himedia®).

2.4 Atividade antimicrobiana in vitro dos isolados de BAL

A detecção da atividade antimicrobiana dos isolados de BAL seguiu a metodologia descrita por Silva (2019), com adaptações. Em placas de petri contendo ágar MRS, foram adicionados três discos de papel estéril, com aproximadamente seis mm de diâmetro e com distanciamento entre eles. Em cada um dos discos, inoculou-se aproximadamente 10 µl de cepas de BAL previamente ativadas em caldo BHI enriquecido com 5% de extrato de levedura (Acumedia®) (incubação a 37 ºC/72 h). A análise foi realizada em duplicata e a incubação em atmosfera modificada de CO₂ a 37 °C por 48 horas.

Após ativação de L. monocytogenes INCQS 00673 (Lote: 0615673 - Instituto Nacional de Controle de Qualidade da Fundação Oswaldo Cruz - INCQS – Fiocruz), em Ágar Nutriente, foi realizada sua diluição em solução salina a 0,85% até a concentração de 0,5% de acordo com a escala Mc Farland, sendo em seguida, inoculado 1,0 mL dessa solução em 9,0 mL do meio TSA (Tryptic Soy Agar - Prodimol®) semissólido.

O meio TSA contendo o patógeno foi utilizado para fazer uma sobrecamada nas placas previamente incubadas com os discos contendo BAL, realizando-se nova incubação em jarras de anaerobiose com atmosfera modificada de CO₂ a 37 °C por 48 h. Após este período, foi realizada a leitura de presença de formação de halos ao redor dos discos.

2.5 Prova de produção de diacetil

Para a prova de produção de diacetil foi utilizada a metodologia de Almeida Júnior (2015), com adaptações. Em tubos de ensaio esterilizados foram adicionados 10 mL de leite integral UHT, em seguida, foi adicionado 1,0 mL da cultura de BAL a ser analisada e foi direcionado para incubação a 24 °C por 24 h. Após a incubação foi retirado 1,0 mL da cultura e adicionado em um tubo contendo 0,5 ml de hidróxido de potássio (KOH) 16% e 0,5 mL de $\textcolor{red}{}\text{α}$–naftol 1%, o qual foi incubado a 30 ºC por 30 min. Em seguida foi realizada a leitura, sendo consideradas positivas para produção de diacetil as cepas em que os tubos apresentaram coloração rósea na superfície, enquanto aqueles sem alteração de cor são considerados negativos.

2.6 Prova de lactofermentação

Em tubos contendo 10 mL de leite em pó desnatado reconstituído a 10% (m/v), previamente esterilizado, foi adicionado alíquota de 20 µL das cepas analisadas, sendo incubadas a 30 ºC por 24 h. Após a incubação foi realizada a leitura do tipo de coágulo formado nos tubos. Os resultados foram determinados a partir do tipo de coágulo formado como: gelatinoso/uniforme; caseoso/esponjoso (BRAMLEY; MCKINNON, 1990).

3 Resultados e Discussão

Neste estudo as amostras de leite cru apresentaram contagem de BAL entre 10² e 10⁴ UFC/mL. As BAL representam cerca de 20 a 30% da microbiota do leite e sua contagem pode sofrer variações, as quais podem estar relacionadas a fatores como a região geográfica de origem, o clima, o tipo de ordenha, a higienização dos manipuladores e utensílios ligados ao processamento; além disso, as características autóctones de cada localidade podem influenciar na diversidade da microbiota (DELAVENNE et al., 2012; FREIRE, 2017; HERMANNS et al., 2013; MORAES et al., 2010; OLIVEIRA, 2015; RONCATTI, 2016; SILVEIRA et al., 2019).

Silveira et al. (2019), ao analisarem amostras de leite cru do 1º e 4º distritos de Bom Jesus do Itabapoana/RJ, encontraram contagens de BAL variando entre 10³ e 10⁶ UFC/mL. Presume-se que essa maior amplitude e diferença nos valores máximos de UFC/mL, quando comparadas ao presente estudo, podem estar relacionadas aos fatores de variação anteriormente mencionados, necessitando de mais estudos para detectar suas origens.

Para a contagem de BAL presentes nas amostras de queijo frescal artesanal, foi observado um padrão de contagem de 10³ a 10⁹ UFC/g. Foi verificada uma ampla variação, sendo que tal fato pode estar relacionado ao processamento do queijo, ao tempo e condições de estocagem, à qualidade higiênico-sanitária do leite e dos manipuladores, entre outros fatores, pois podem propiciar condições para o crescimento de outros microrganismos, criando um ambiente de competição. Em estudos realizados por Santos (2010); Resende et al. (2011); Castro (2015) e Oliveira (2018), analisando queijos oriundos da Serra de MG, foram obtidas contagens acima de 10⁷ UFC/g.

A alta contagem de BAL em queijo frescal artesanal está associada à microbiota endógena do leite ligado ao processamento na produção de queijo, onde a retirada do soro condensa a parte sólida do leite, o que favorece a multiplicação das bactérias láticas e consequente continuação do processo de fermentação (RESENDE, 2010; SOUZA; ROSA; AYUB, 2003).

Das 96 cepas obtidas a partir das amostras de leite cru e queijo frescal artesanal, 25 apresentaram características para BAL, das quais 52% expressaram morfologia de cocos e 48% de bacilos, não se detectando, assim, predominância entre um tipo morfológico e o outro. Nos estudos realizados por Neves (2017) e Giazzi (2017), nos estados de MG e PR, respectivamente, foi observado que os isolados analisados oriundos de queijo frescal artesanal e leite in natura apresentaram baixa variação no que se refere a morfologia (cocos e bacilos). Uecker (2017), ao analisar isolados obtidos de leite in natura e de outros produtos lácteos, localizados no RS, observou que havia mais cocos do que bacilos, sendo que 65% deles apresentaram morfologia de cocos e 35% de bacilos. Acredita-se que a morfologia de BAL pode variar de uma região para outra, podendo ser determinada pelas características autóctones de uma região, por seu clima, pelo tipo de processamento e outros.

Para o estudo das características antimicrobianas, produção de diacetil e perfil de lactofermentação foram utilizadas 10 cepas escolhidas aleatoriamente (Quadro 1).

Buscando caracterizar as cepas isoladas, foi possível agrupá-las em sete grupos, de forma a perceber suas similaridades e diferenças:

1. - Quatro cepas (L1, L3, L5 e Q3) com morfologia tipo cocos apresentaram ação antagonista contra L. monocytogenes, produção de diacetil e lactofermentação tipo caseosa.

2. - Uma cepa (Q2) com morfologia tipo cocos não apresentou ação antagonista contra L. monocytogenes, não produziu diacetil e a lactofermentação foi caseosa.

3. - Três cepas (L2, L6 e Q1) com morfologia tipo bastonete apresentaram ação antagonista contra L. monocytogenes, produção de diacetil e lactofermentação tipo caseosa.

4. - Uma cepa (Q4) com morfologia tipo bastonete não apresentou ação antagonista contra L. monocytogenes, não produziu diacetil e apresentou lactofermentação gelatinosa.

5. - Uma cepa (L4) com morfologia tipo bastonete não apresentou ação antagonista contra L. monocytogenes, não produziu diacetil e apresentou lactofermentação do tipo caseosa.

Observou-se que 70% dos isolados apresentaram inibição contra L. monocytogenes,esses resultados são condizentes com os encontrados por Tamanini & Gerner-Smidt.2012), Giazzi (2017), Brumano (2016), Schittler (2012) e Costa et al. (2013), que verificaram que a maior parte dos isolados de BAL oriundos de leite cru e queijo frescal foram capazes de inibir o desenvolvimento de L. monocytogenes. Resultados semelhantes também foram obtidos em outros trabalhos utilizando BAL oriundas de outras matrizes alimentares (COSTA, 2016; COSTA, 2019; FONTANA et al., 2015; LIMA, 2016). O presente estudo não verificou a natureza do mecanismo de inibição frente a L. monocytogenes, porém foi possível observar que todos os isolados que apresentaram antagonismo bacteriano também apresentaram produção de diacetil.

Diversas pesquisas apontam o diacetil como uma das substâncias relacionadas com a capacidade de ação antimicrobiana exercida pelas BAL. Essa ação antimicrobiana está relacionada à produção de ácidos orgânicos (ácido lático), peróxido de hidrogênio, diacetil e outros (DUARTE et al., 2016; PEREIRA; GOMÉZ, 2012).

Observou-se que todas as cepas que sintetizaram diacetil também apresentaram inibição ao patógeno, o que sugere a tendência de relação da produção deste composto com a capacidade de inibição do patógeno pelas cepas de BAL. Essa ação do diacetil provavelmente está relacionada com sua capacidade de bloquear a produção de proteínas essenciais à célula bacteriana patogênica. (LANCIOTTI et al., 2003; OUWEHAND; VESTERLUND, 2004).

As cepas de lactofermentação gelatinosa não apresentaram ação antagonista e produção de diacetil. Além disso, foi verificado que 80% dos isolados formaram coágulos caseosos (oriundo da fermentação proteolítica) e 20% gelatinosos (fermentação lática), sendo esta uma característica tecnológica considerada normal e desejável à indústria de laticínio, visto que é uma prova de caracterização do tipo de lactofermentação das BAL (SABEDOT et al., 2011). Martins (2018), ao avaliar o perfil de lactofermentação de cepas oriundas de queijo e leite, verificou que as BAL apresentaram coagulação caseosa. Em nossa pesquisa, todos os isolados oriundos de leite cru apresentaram o mesmo tipo de lactofermentação, do tipo caseoso.

4 Conclusão

Com os resultados deste estudo pode-se pressupor que a partir das características apresentadas pelos isolados frente às análises realizadas, os isolados são diferentes, podendo-se pressupor um mínimo de sete cepas. As cepas que apresentaram lactofermentação gelatinosa não produziram diacetil e não apresentaram ação antagônica contra L. monocytogenes, sendo ambas procedentes de queijo. Devido ao possível potencial das cepas para uso em alimentos, pretende-se continuar os estudos com os isolados que apresentaram potencial antimicrobiano contra L. monocytogenes, de forma a obter maior caracterização dos mesmos.

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Notas de autor

Información adicional

COMO CITAR (ABNT): SILVA, L. G.; LOPES, D. S.; BASTOS, P. A. M. B. Caracterização de bactérias ácido láticas autóctones de Bom Jesus do Itabapoana/RJ: ação antagonista contra Listeria monocytogenes e provas bioquímicas. Vértices (Campos dos Goitacazes), v. 24, n. 1, p. 194-208, 2022. DOI: https://doi.org/10.19180/1809-2667.v24n12022p194-208. Disponível em: https://www.essentiaeditora.iff.edu.br/index.php/vertices/article/view/15990.

COMO CITAR (APA): Silva, L. G., Lopes, D. S. & Bastos, P. A. M. B. (2022). Caracterização de bactérias ácido láticas autóctones de Bom Jesus do Itabapoana/RJ: ação antagonista contra Listeria monocytogenes e provas bioquímicas. Vértices (Campos dos Goitacazes), 24(1), 194-208. https://doi.org/10.19180/1809-2667.v24n12022p194-208.